摘要:目的]探讨抑制心肌细胞P53,增加葡萄糖转运体4(GLUT4)表达,能否改善高糖(HG)合并缺血缺氧(IH)诱导的心肌细胞糖代谢紊乱,减轻细胞凋亡。 [方法]建立体外HG＋IH心肌细胞模型,实验分为:对照组、HG组、IH组、HG＋IH组、HG＋IH＋P53抑制剂组(HG＋IH＋Pifithrin-α组)、HG＋IH＋P53抑制剂＋GLUT4抑制剂组(HG＋IH＋Pifithrin-α＋Fasentin组)。CCK-8法检测细胞活力,试剂盒检测乳酸脱氢酶(LDH)、糖酵解关键酶活性和ATP含量,Western blot检测P53、GLUT4、Bax/Bcl-2和Caspase-3的蛋白表达,流式细胞仪检测心肌细胞凋亡。 [结果]①体外HG＋IH心肌细胞模型中,与对照组比较,心肌细胞P53表达增加75%,GLUT4表达减少16%,细胞ATP含量下降51%,细胞活力减低45%,LDH活性增加3.6倍,Caspase-3和Bax/Bcl-2表达分别增加54%和77%,细胞凋亡率增加(P均＜0.05)。②抑制心肌细胞P53表达后,与HG＋IH组比较,HG＋IH＋Pifithrin-α组心肌细胞GLUT4表达增加34%,细胞ATP含量增加60%,细胞活力增加50%,LDH活性减低13%,Caspase-3和Bax/Bcl-2表达分别减少31%和53%,细胞凋亡率下降(P均＜0.05)。③在抑制GLUT4后,与HG+IH+Pifithrin-α组比较,HG+IH+Pifithrin-α+Fasentin组GLUT4表达减少22%,细胞内ATP含量减少39%,细胞存活力减低25%,LDH活性增加21%,Caspase-3和Bax/Bcl-2表达分别增加43%和89%,细胞凋亡率增加(P均＜0.05)。 [结论]在高糖合并缺血缺氧心肌细胞模型中,抑制P53可增加GLUT4表达,改善高糖合并缺血缺氧诱导的心肌细胞糖代谢紊乱,减轻细胞凋亡。

摘要:目的]探讨细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂2B反义RNA 1(CDKN2B-AS1)是否通过靶向miR-98-5p影响高糖诱导的人脐静脉内皮细胞(HUVEC)损伤。 [方法]将HUVEC分为对照组(含5 mmol/L葡萄糖的DMEM培养)、模型组(含33.5 mmol/L葡萄糖的DMEM培养)、模型＋si-NC组、模型＋si-CDKN2B-AS1组、模型＋miR-NC组、模型＋miR-98-5p模拟物组、模型＋si-CDKN2B-AS1＋anti-miR-NC组、模型＋si-CDKN2B-AS1＋anti-miR-98-5p组。运用实时定量聚合酶链反应检测HUVEC的CDKN2B-AS1、miR-98-5p表达；Western blot检测信号转导及转录激活因子3(STAT3)蛋白表达；流式细胞术检测细胞凋亡；超氧化物歧化酶(SOD)、乳酸脱氢酶(LDH)、丙二醛(MDA)试剂盒检测SOD、LDH、MDA水平。双荧光素酶报告实验分析miR-98-5p与CDKN2B-AS1、STAT3的靶向结合。 [结果]高糖使HUVEC中CDKN2B-AS1、STAT3表达、凋亡率、LDH、MDA水平升高,miR-98-5p表达、SOD水平降低(P＜0.05)。沉默CDKN2B-AS1或过表达miR-98-5p后,高糖诱导的HUVEC中CDKN2B-AS1、STAT3表达、凋亡率、LDH、MDA水平降低,miR-98-5p表达、SOD水平升高(P＜0.05)。双荧光素酶报告实验显示,CDKN2B-AS1靶向miR-98-5p,miR-98-5p靶向STAT3。抑制miR-98-5p逆转了沉默CDKN2B-AS1对高糖诱导的HUVEC凋亡、氧化应激、STAT3蛋白表达的抑制作用。 [结论]沉默CDKN2B-AS1通过调节miR-98-5p/STAT3轴抑制高糖诱导的HUVEC氧化应激和凋亡,CDKN2B-AS1可作为糖尿病相关血管并发症的候选治疗靶标。

摘要:目的]探讨柚皮素(NAR)对高糖(HG)诱导的大鼠心肌细胞(H9c2)凋亡及核因子E2相关因子2(Nrf2)/抗氧化反应元件(ARE)信号通路的影响。 [方法]将培养的H9c2细胞分为对照组(正常糖量)、HG组(35.5 mmol/L葡萄糖)、HG＋NAR低、中、高浓度组(35.5 mmol/L葡萄糖＋6.25、12.5、25.0 μmol/L NAR)。用噻唑蓝法检测H9c2细胞增殖活性；流式细胞术检测细胞凋亡；二氯二氢荧光素二乙酸酯荧光探针染色法检测细胞内活性氧(ROS)水平；Western blot法检测Nrf2、血红素加氧酶1(HO-1)、Bax、Caspase-3、Bcl-2蛋白表达水平。 [结果]经HG处理的H9c2细胞增殖活性、Nrf2、HO-1、Bcl-2蛋白表达水平显著降低,细胞凋亡率、ROS水平、Bax、Caspase-3蛋白表达水平显著升高(P＜0.05)。经HG与NAR共同处理H9c2细胞后,NAR低、中、高浓度组H9c2细胞增殖活性、Nrf2、HO-1、Bcl-2蛋白表达水平显著升高,细胞凋亡率、ROS水平、Bax、Caspase-3蛋白表达水平显著降低(P＜0.05)。 [结论]NAR可抑制HG诱导的H9c2细胞凋亡,其作用机制可能与激活Nrf2/ARE信号通路密切相关。

摘要:目的 探讨B细胞κ轻肽基因增强子核因子1(NFKB1)基因启动子区-94位点ATTG插入/缺失突变对高糖高脂微环境诱导人脐静脉内皮细胞(HUVEC)损伤的影响及其潜在机制。方法 建立NFKB1不同基因型原代HUVEC细胞的高糖高脂模型,采用Annexin-V-FLUOS染色检测细胞凋亡,Mito Tracker染色后通过激光共聚焦显微镜观察线粒体形态,Western blot检测核因子κB(NF-κB)信号通路中p50、p65蛋白,线粒体分裂相关蛋白Drp1、Drp1-s637、Drp1-s616和Fis1,线粒体融合相关蛋白Mfn1、Mfn2和Opa1,以及凋亡相关蛋白细胞色素C(CytC)。结果 高糖高脂诱导原代HUVEC凋亡显著增加,与Ⅱ型细胞相比,DD型细胞凋亡指数更高；线粒体过度分裂成碎片状；DD型细胞中NF-κB通路中关键蛋白p50表达明显降低,线粒体融合相关蛋白Mfn2表达降低,线粒体分裂动力相关蛋白Drp1-s616磷酸化增加,CytC表达增加。结论 NFKB1基因缺失突变可能是DD型HUVEC更容易受到高糖高脂微环境损伤的重要原因,其潜在的机制可能与线粒体过度分裂相关。

摘要:目的 研究利拉鲁肽对高糖条件下HepG2细胞胆固醇流出的影响,检测相关蛋白表达并探讨其分子机制。方法 体外培养HepG2细胞,以高糖刺激并以不同浓度利拉鲁肽干预,采用BODIPY-胆固醇荧光法检测利拉鲁肽对高糖条件下HepG2细胞胆固醇流出的影响,通过Western blot法分析三磷酸腺苷结合盒转运体A1(ABCA1)、ABCG1与清道夫受体B1蛋白表达及细胞外调节蛋白激酶1/2(ERK1/2)信号通路变化。结果 利拉鲁肽可显著降低高糖(50 mmol/L)条件下HepG2细胞内荧光密度,增加ABCA1蛋白的表达,且增强ERK1/2的磷酸化水平。结论 利拉鲁肽增强高糖条件下HepG2细胞中胆固醇流出,其机制可能与调控ERK1/2信号通路进而上调ABCA1表达有关。

摘要:目的 研究血管紧张素(1-7)[Ang(1-7)]/Mas受体轴能否通过调控ATP敏感性钾通道(KATP通道)对抗高糖引起的人脐静脉内皮细胞(HUVEC)损伤。 方法 应用40 mmol/L葡萄糖(高糖)作用HUVEC 24 h建立糖尿病血管内皮细胞损伤模型,应用蛋白免疫印迹法检测KATP通道蛋白的表达水平,CCK-8检测细胞存活率,乳酸脱氢酶(LDH)试剂盒检测细胞培养液中LDH活性,Hoechst33258核染色荧光显微镜照相法检测凋亡细胞数量,双氯荧光素染色荧光显微镜照相法测定细胞内活性氧(ROS)水平,罗丹明123染色荧光显微镜照相法测定线粒体膜电位(MMP),ELISA检测培养液中白细胞介素1β(IL-1β)和肿瘤坏死因子α(TNF-α)的分泌水平。 结果 高糖分别作用HUVEC 1～24 h,从3 h起KATP通道蛋白的表达水平呈时间依赖性降低,在24 h时KATP通道蛋白的表达下降最明显。20 μmol/L Ang(1-7)和高糖共处理HUVEC 24 h可抑制高糖对KATP通道蛋白表达的下调。此外,20 μmol/L Ang(1-7)共处理或100 μmol/L吡拉地尔(KATP通道开放剂)预处理细胞均能对抗高糖引起的HUVEC损伤,使细胞存活率升高,LDH活性降低,凋亡细胞数量、ROS生成、MMP丢失及IL-1β和TNF-α的分泌减少。10 μmol/L A-779(Mas受体拮抗剂)共处理或1 mmol/L格列本脲(KATP通道阻断剂)预处理均能阻断Ang(1-7)的上述细胞保护作用。 结论 Ang(1-7)/Mas受体轴通过调控KATP通道对抗高糖引起的HUVEC损伤。

摘要:目的 探讨内质网应激是否介导了高糖引起的血管平滑肌细胞(VSMC)钙化。方法 体外高糖(35 μmol/L D-葡萄糖)处理VSMC模拟糖尿病环境,观察高糖是否引起VSMC内质网应激反应和凋亡,探索高糖是否引起VSMC表型转化(收缩型转变为成骨样细胞),观察内质网应激诱导剂和抑制剂对VSMC钙化的影响,碱性磷酸酶(ALP)活性、钙沉积和骨分化转录因子(Runx2和Osterix) 通过比色法、O-cresolphthalein法和Western blot测定。结果 应用35 μmol/L D-葡萄糖分别处理VSMC不同时间,可以上调VSMC内质网应激标志蛋白表达、ALP活性、钙沉积和骨分化标志蛋白；然而,4-PBA预处理抑制VSMC内质网应激反应的同时,也能阻断高糖引起的VSMC钙化,表现为ALP活性、钙沉积和骨分化标志蛋白下降。结论 高糖可以激活VSMC的内质网应激和凋亡,进而促VSMC钙化的发生,提示可能内质网应激介导了此激活过程。

摘要:目的 探讨外源性硫化氢(H2S)能否通过抑制活性氧(ROS)-Toll样受体4(TLR4)通路对抗高糖诱导的H9c2心肌细胞损伤和炎症反应。方法 应用细胞计数盒(CCK-8)检测细胞存活率,用试剂盒检测细胞培养液中乳酸脱氢酶(LDH)活性,ELISA检测细胞培养液中白细胞介素1β(IL-1β)和肿瘤坏死因子α(TNF-α)的水平,Hoechst 33258核染色荧光显微镜照相法测定凋亡细胞数量,Western blot测定TLR4和Cleaved Caspase 3蛋白的表达水平,双氯荧光素染色荧光显微镜照相法测定细胞内ROS水平,罗丹明 123染色荧光显微镜照相法检测线粒体膜电位(MMP)。结果 应用35 mmol/L葡萄糖(高糖)作用H9c2心肌细胞24 h能上调TLR4的表达水平。在高糖作用前,应用1000 μmol/L N-乙酰半胱氨酸(NAC)预处理60 min或400 μmol/L硫氢化钠(NaHS)预处理30 min能明显减轻高糖对TLR4蛋白表达的上调作用。高糖作用心肌细胞24 h可引起心肌细胞损伤和炎症反应,使细胞存活率降低,LDH活性、凋亡细胞数量、Cleaved Caspase 3蛋白的表达、ROS生成、MMP丢失及IL-1β和TNF-α的分泌增加；400 μmol/L NaHS预处理心肌细胞30 min后再予高糖作用24 h或30 μmol/L TAK-242(TLR4抑制剂)和高糖共处理心肌细胞24 h能显著拮抗高糖引起的上述损伤和炎症反应。结论 外源性H2S可通过抑制ROS-TLR4通路对抗高糖诱导的H9c2心肌细胞损伤和炎症反应。

摘要:目的　探讨高糖环境下原花青素（OPC）对体外培养的大鼠内皮祖细胞血管内皮生长因子受体2（VEGFR-2）及其下游相关通路的影响。方法　采用Ficoll密度梯度离心法分离大鼠骨髓内皮祖细胞（EPC）；分别检测正常糖组（5.5　mmol/L葡萄糖＋25　mmol/L甘露醇）、高糖组（30　mmol/L葡萄糖）培养的EPC增殖和氧化应激产物产生情况，再通过在不同原花青素浓度下检测各时间点EPC增殖的方法，筛选出最佳原花青素浓度（30　mg/L）；分别用Matrigel基质胶检测正常糖＋OPC组、正常糖组、高糖＋OPC组、高糖组EPC成管能力；最后在1、3、5、7天分别检测正常糖＋OPC组、正常糖组、高糖＋OPC组、高糖组EPC的丙二醛水平以及VEGFR-2、p-AKT、核因子κB（NF-κB）和核因子κB抑制蛋白α（IKB-α）的相对表达量。结果　随时间推移，高糖组中EPC细胞凋亡和氧化应激产物均较正常糖组逐渐增多；正常糖＋OPC组、正常糖组EPC成管数目无明显差异，高糖＋OPC组成管数目较高糖组明显增多；在1、3、5、7天时OPC在正常糖浓度下对EPC产生的氧化应激产物及VEGFR-2、p-AKT、NF-κB和IKB-α蛋白的相对表达量没有显著影响，而在高糖环境下可以明显降低氧化应激产物的生成及上调VEGFR-2、p-AKT和NF-κB蛋白相对表达量，下调IKB-α蛋白相对表达量。结论　原花青素可能通过缓解高糖环境对EPC的氧化损伤作用，上调内皮祖细胞VEGFR-2及其下游通路蛋白表达，进而促进细胞增殖。

摘要:目的　探讨高糖对内皮细胞舒缩功能障碍等损害过程中是否有肾素（前体）受体（（P）RR）的过度激活，并探讨其机制。方法　体外培养人脐静脉内皮细胞，分别以不同浓度的葡萄糖（15、30　mmol/L）干预细胞24　h、48　h后收取细胞，用分子生物学方法测定（P）RR以及反映血管舒缩功能的生物标记物蛋白和mRNA的表达，以siRNA的方法抑制（P）RR的表达后，观察葡萄糖对内皮细胞上述作用的改变，进一步分析其机制。结果　高糖显著上调内皮细胞（P）RR的蛋白和mRNA表达；同时上调内皮素1（ET-1）的表达，抑制一氧化氮（NO）的合成。（P）RR-siRNA虽能抑制高糖引起的ET-1　mRNA表达增高，但不抑制其蛋白表达。（P）RR-siRNA显著抑制高糖引起的NO降低。高糖抑制内皮型一氧化氮合酶（eNOS）的表达，增加非对称性二甲基精氨酸（ADMA）的合成，（P）RR-siRNA能显著抑制高糖对eNOS和ADMA的影响。结论　高糖能够激活内皮细胞（P）RR的表达；（P）RR可能通过ADMA/eNOS通路介导了高糖诱发的血管内皮舒缩功能障碍。